前言

    过去的十年中，已经相当清晰地阐明了雌性激素对生长的调节作用。雌性激素不敏感性或雌性激素缺乏病人的案例报告证明，对生长板的雌性激素作用丧失，骨骺仍然开放，纵向生长继续很长时间。在这些观察的基础上，可以提出芳香化酶抑制剂阻断雌性激素生物合成可调节纵向生长的假设，芳香化酶抑制剂能够抑制C₁₉的雄性激素（主要是雄烯二酮和睾酮，T）向C₁₈雌性激素的芳香化作用。

    以相对较弱的芳香化酶抑制剂-睾内脂治疗先天性肾上腺增生、家族性限于男性性早熟和McCune-Albright综合症的研究，确实提示了芳香化酶抑制剂至少能有效延迟外周性性早熟儿童骨成熟和增加预测的成年身高（PAH）。但是，这些研究未设置对照组，或PAH的变化未最终确定。第三代芳香化酶抑制剂在抑制力、安全性和耐受性方面都显著优于睾内脂。至今，仅有一项安慰剂（Pl）对照研究估价了现代芳香化酶抑制剂延迟骨成熟、增加PAH的效果，在这项研究中，对青春期延迟男孩以来曲唑（Lz）结合T治疗1年显著延迟了骨成熟，PAH增加了5.1cm。

    因为抑制雌性激素生物合成对生长障碍男孩骨成熟和PAH的影响仍然不清晰，我们完成了一项对特发性矮身高（ISS）男孩以Lz或Pl治疗2年的随机化、双盲、安慰剂对照实验研究。我们检验了以芳香化酶抑制剂阻断雌性激素生物合成能够延迟骨成熟，因而增加PAH，最终得到更高的成年身高的假设。我们也研究了芳香化酶抑制剂对男孩青春期前及其向青春期转换过程中的促性腺激素分泌和骨矿化的影响。

受试者和方法

受试者

    研究人群由矮身高男孩组成，在赫尔辛基大学儿童医院儿科内分泌门诊（芬兰，赫尔辛基）进行身体检查和跟踪。这些儿童无矮身高基本疾病的症状，通过系统的生长图表和病历评价而确定。当在研究中重复评价时，经病历、临床检查和常规实验室检验无症状的男孩确认为ISS，进入研究。包括的标准为生活年龄9.0-14.5岁，身高低于平均数至少2 SDS或低于父母身高中值靶身高至少2 SDS。排除骨龄大于14岁的男孩。如果根据缓慢生长速度或血清IGF-I或IGF-I结合蛋白-3异常而怀疑GH缺乏，则通过生长激素刺激试验进行排除。未将出生时的小于孕龄儿作为排除标准，分别有4名和3名小于孕龄儿受试者服用Lz和安慰剂。

    在2001年5月至2002年5月，有40名男孩符合进入标准。在初始评价和资料准备后最终有31名ISS男孩参加研究。开始治疗前，由男孩或其监护人获得知情同意书。因为哮喘，1名Lz组和1名Pl组男孩在接受连续低剂量吸入糖皮质激素治疗，3名Lz组和1名Pl组男孩接受季节性吸入糖皮质激素治疗。除此而外，所有男孩均不存在已知影响生长或骨成熟的治疗。在6个月治疗后，服用安慰剂的1名男孩诊断为糖尿病而被排除。

研究方案

    以双盲方式将男孩随机分为2年的Lz（2.5mg, 口服，每天一次）组或Pl组（口服，每日一次）。在医院药房计算机生成随机表进行随机化分组，在追踪结束之前研究者和受试者均不了解治疗分配，在数据输入计算机后才向研究者公开随机化编码。

    在进入研究时和此后2年内的每6个月对这些男孩进行检查。追踪访问中的身体检查均由同一名医生完成。根据Tanner方法评价青春期发育等级，使用公式：长x 宽²x 0.52计算睾丸体积，以0.1cm精度的Harpenden测距仪测量身高。

    研究方案得到医院伦理委员会和国家药物管理局批准。

放射学测定

    每6个月应用双能X线吸收法测量腰椎和股骨颈骨矿物质密度（BMD），以投照面积标准化骨矿物质含量测定面积BMD，但未考虑测量部位骨深度的差异。因此面积BMD被骨的大小所混淆。为了修正，也以公式：骨矿物质含量/（投照面积）^1.5计算表观密度（BMAD，g/m³）

    以Greulich 和 Pyle法评价骨龄，以Bayley-Pinneau法预测成年身高。两名男孩在研究开始时骨龄不足6岁，成年身高预测由Bailey-Pinneau表外推而计算。

生物化学测定

    在07:30至10:00之间取静脉血样。在跟踪随访后立即测定血清FSH, LH, IGF-I,和抑制素B浓度。测定血清T和雌二醇浓度的血清在-20℃保存。使用改良的放射免疫方法（RIA）测定血清T和雌二醇浓度，雌二醇测定限度为1.2 pg/ml (4.5 pmol/l)。在浓度1.1和6.0 pg/ml(4.2和22 pmol/l)时，批间变异系数(CVs)分别为40%和12%；在浓度6.0 pg/ml (22 pmol/l)以上时在16%以下。在浓度1.3–35.4 pg/ml (4.6–130 pmol/l)，批内变异系数小于14%。使用超灵敏度的荧光免疫方法测量血清LH和FSH水平。使用RIA方法测定血清IGF-I浓度，在浓度69–252 µg/l (9–33 nmol/l)时批间变异系数小于16%。使用酶免吸附测定法（ELISA）测量血清抑制素B，检测限度为5.6 ng/l，在229, 85,和42 ng/l浓度时批间变异系数分别为6.9%, 10.1%,和12.0%；批内变异系数小于5%。

统计学分析

    研究的一级终点为Lz改善PAH的效果，以治疗24个月后PAH的变化度量，第二，我们探索在男性青春期前及其向青春期转换过程中雌性激素在下丘脑-垂体-睾丸轴和骨矿化调节中的作用。

    为计算所要求的样本大小，根据以前的研究结果，PAH最小临床显著性治疗效果设定为5cm。PAH变化的SD定为4.7cm。显著性水平为0.05和80%的可能性，最小适合样本为28名受试者，假设最大丢失率为10%，我们至少需要31名男孩。

    在以前的研究中，我们证明在Lz治疗的青春期男孩，通过雌性激素水平调节的负反馈降低而增强促性腺激素分泌。因此，Lz加快睾丸生长，增强T分泌。在青春期开始后Lz作用的基础上，为分析垂体-睾丸功能，将男孩分为两组：在追踪期始终处于青春期前的男孩（睾丸体积≤2ml）为一组，在开始治疗后18个月内进入青春期的男孩（睾丸体积＞2ml）为另一组。根据这些标准，在Lz组和Pl组分别有7名和6名男孩分为青春期前，9名和8名男孩进入青春期组。

    使用双尾检验假设，P <0.05为显著性水平。数据以平均数±SD表示。以SPSS统计学软件进行分析。使用非配对t检验分析基线特征。使用配对的和非配对t检验分析组内骨龄变化和组间骨龄增长差异、骨龄身高SDS和PAH。使用配对t检验估价血清FSH, LH, T, E2, 抑制素B,和IGF-I浓度，睾丸体积以及BMD的组内变化。使用治疗（Lz/Pl）作为受试者间因子，应用重复测量的ANOVA来分析 T, 雌性激素, 抑制素 B,和IGF-I组间差异。如需要使用对数转换数据。使用非配对t检验分析睾丸体积组间差异以及青春期男孩LH和FSH变化组间差异。在多重比较检验后，使用Friedman检验估价Tanner生殖器（G）和阴毛(P)等级的组内变化。使用Mann-Whitney U 检验评价Tanner G和P等级组间差异。

结果

基线特征

     在基线时，年龄、身高、体重、骨龄、骨龄身高、青春期发育等级、睾丸体积以及父母身高中值靶身高均无组间差异（表1）。开始治疗之前所有男孩均无青春期生长速度的增长。

生长学

    在研究过程中，Lz和Pl治疗的男孩生长速度类似（图1A）。在治疗的第二年，Lz治疗的男孩在12个月时间点上进入青春期，生长速度快于仍然为青春期前的Lz治疗男孩(n = 8; 6.7与4.5 cm/yr; P = 0.04)；同样，在12个月进入青春期的Pl治疗男孩（n=5）第二年生长速度也快于仍为青春期前（n=9）的Pl治疗男孩(7.4与4.6 cm/yr; P = 0.004)。在治疗的第二年，Lz和Pl治疗的青春期男孩生长速度无差异(分别为6.7

    在Lz治疗的男孩，2年治疗期间骨龄仅增长1.24岁，而Pl治疗的男孩同期骨龄增长2.05岁（骨龄变化/生活年龄变化分别为0.62与1.02，P =0.04，图1B）。因此，Lz治疗组的骨龄身高增加了0.7 SDS，而Pl组无变化（图1C）。同样，Lz治疗男孩的PAH增加了5.9cm(P < 0.0001)，而以Pl治疗的男孩未发生变化。虽然在开始时，组间PAH无差异，但在治疗期结束时Lz治疗组的PAH高于Pl治疗男孩(172.8与166.9 cm; P = 0.03; 图1D)。

    Lz治疗有效性似乎与骨龄无关，因为在研究开始时Lz治疗男孩的骨龄与骨龄身高SDS变化 (r = 0.05; P = 0.85) 或是PAH变化(r = –0.06; P = 0.83)无相关。而且，青春期前与青春期Lz治疗男孩在2年治疗期间的PAH增加相似(分别为7.2与4.8 cm, P = 0.17)。

    治疗期间Pl组和Lz男孩体重增长方式类似(3.7与4.2 kg/yr; P = 0.37)，体重指数无组间差异（数据未列出）。

青春期成熟和激素变化

    在研究中，Lz和Pl组进入青春期的男孩比例相似，在开始时16名Lz中的13名（81%），14名Pl中的13名（93%）为青春期前。2年治疗后，两组分别有7名（44%）和6名（43%）保持在青春期前。在研究开始后的18个月内进入青春期男孩的Tanner G等级组间差异无显著性（表2）。但Lz治疗的青春期男孩在开始治疗后的12和18个月有较高的Tanner P等级（表2），其睾丸体积增长更迅速，在开始治疗后的6个月已经明显（表2）。事实上，除了一名男孩外，所有Lz治疗的青春期男孩在2年治疗后睾丸体积≥10ml，所有Pl治疗的男孩睾丸体积在10ml以下。

    在研究期间保持在青春期前的男孩，组间FSH, LH, T,雌二醇, IGF-I, 和抑制素 B浓度无差异（数据未列出）。而除了抑制素B以外，Lz和Pl组的青春期男孩相应指标数值变化不同（图2）。在18个月内以Pl治疗的进入青春期男孩，血清LH浓度由0.6 IU/l逐渐增加到2.4 IU/l (P = 0.0002)；而Lz治疗的男孩则不大相同，在开始治疗后的6个月，LH浓度由1.0 IU/L基线值更迅速低增加到4.5IU/L(P = 0.002)，并在治疗期LH浓度始终高于Pl治疗的青春期男孩（图2）。Lz治疗的青春期男孩FSH浓度高于Pl治疗青春期男孩（图2），其变化方式与上述LH比较相似。开始治疗后，前者血清T浓度迅速增长并超过后者（图2）。在24个月治疗后，Lz治疗的青春期男孩平均T浓度达到892 ng/dl (范围, 17.3–1385 ng/dl), 30.9 nmol/l(范围, 0.6–48.0 nmol/l)。在治疗期内，Lz治疗的青春期男孩血清雌二醇浓度始终保持在治疗前水平，而Pl治疗的青春期男孩在治疗后18个月出现增长的趋势（图2）。

    Lz组和Pl组青春期男孩治疗期间的血清IGF-I浓度变化不同（图2），在开始治疗后的18个月(P < 0.001)和24个月(P < 0.05)Pl治疗的青春期男孩IGF-I浓度较高。

骨矿化

    治疗中两组男孩腰椎和股骨颈面积BMD的增长相似（图3，A和B）。Lz组的腰椎BMAD增长（中位数增加4.3%；P = 0.009），但Pl组未增长（中位数增加0.5%；P = 0.21；P = 0.21，图3C）。在两治疗组，青春期男孩的腰椎和股骨颈BMD增长大于青春期前男孩(P < 0.01–0.05)，Lz和Pl组青春期男孩腰椎面积BMD分别增加了0.07和0.06 g/cm²，股骨颈BMD分别增加了0.07和0.05 g/cm²，而青春期前男孩前者指标仅增加了0.03 g/cm²（两组），后者指标分别增加了0.01和0.03 g/cm²。

箱表示了四分位数范围（数值的50%）和中位数，细线表示了数值的全部范围，空心圆为排除的异常值。与基线相比的变化：*, P < 0.05; , P < 0.01; , P < 0.001

讨论

    在检验雌性激素生物合成的抑制延迟骨成熟，因而增加矮身高男孩PAH的假设中，我们在ISS青少年男孩，比较了芳香化酶抑制剂对Lz组和Pl组PAH的影响，发现2年的Pz治疗显著延迟骨成熟，PAH增加5.9cm，与我们的假设一致。我们的雌性激素对男性骨成熟有关键作用的结果也与在雌性激素不敏感性、雌性激素缺乏男子，以及以前我们以Lz治疗青春期延迟男孩的发现相一致。但与我们的结果不同，最近的一项对GH缺乏青少年男孩以芳香化酶抑制剂阿那曲唑治疗12个月，发现对PAH的无效果。可能的解释为，在Mauras et al.的研究中治疗时间较短，以及阿那曲唑的效力较低于Lz。

    值得注意的是，在青春期前和青春期的Lz治疗都延迟骨成熟并改善PAH，而与骨龄无关，意味着在雌性激素在儿童期生长板成熟过程中发挥作用。这是一个有趣的结果，因为男孩青春期前睾丸芳香化酶活性很低，可能腺体外组织也如此，因此，只有在男性青春期开始后循环系、自分泌、旁分泌的雌性激素对骨成熟的影响才变得重要。然而，以Lz治疗的青春期前男孩的循环雌二醇水平并不显著低于Pl治疗的青春期前男孩，可能是由于在青春期前低浓度雌性激素下测定方法准确性有限所引起。使用这种灵敏的RIA测定青春期前男孩的雌性激素，我们看到血清雌二醇浓度高于以前使用相同方法所报告的数值。差异的原因尚不清楚，可能掩盖了真正浓度的组间（和纵断）差异。但是，因为几种组织能够将雄烯二酮和睾酮转换为雌性激素，所以循环雌二醇浓度不能反映这些组织中的旁分泌和自分泌作用。

    与我们以前对青春期初期和中期男孩的研究一样，我们观察到Lz对雌性激素生物合成的抑制降低了青春期开始后促性腺激素分泌的负反馈控制，血清FSH和LH浓度增加。促性腺激素分泌的增加引起T浓度超生理浓度的升高和迅速的睾丸生长。开始治疗后12和18个月Lz治疗男孩较高的Tanner P等级，提示T水平的增加可加速青春期的进展。但是这种治疗未影响青春期的开始，因为在2年的治疗中Lz组和Pl组进入青春期男孩的比例相似。这与青春期开始前GnRH分泌的控制受到中枢神经系统控制，而不是性类固醇的观点相一致。

    在Lz治疗的青春期男孩，循环IGF-I浓度的变化相反证明，通常由青春期雌性激素调节的GH-IGF-I轴的刺激受到了抑制。因为雌性激素水平增加及其引起的GH-IGF-I轴活动的增强是男性青春期生长突增的主要调节因素，所以奇怪的是Pl和Lz组青春期男孩却以类似的速度生长。在后者所观察到的生长速度有力提示，在低浓度（青春期前）的IGF-I和雌二醇下，可能是高浓度的雄性激素增强了生长速度。这个看法得到了青春期中雄性激素对生长板具有直接的生长刺激作用，在人类生长板中存在雄性激素受体的支持。

    在两组男孩中，腰椎和股骨颈面积BMD以类似的方式增加，而腰椎BMAD仅在lz治疗组显著增加。这些结果提示，2年的芳香化酶抑制剂治疗对于青春期男孩的骨矿化无不利影响。但在成年男性，雌性激素具有重要的骨矿化调节作用，特别是对骨的重吸收，正如雌性激素不敏感性或抵抗的男子BMD显著减少及其直接干涉研究的结果所说明。因为T贡献于男性骨生成的维持，所以可以假设Lz组高浓度的雄性激素代偿了骨重吸收的增加，但是我们的研究中未估价骨转换。

    ISS是一组异类实体，包括家族性矮身高、体质性生长和青春期延迟、GH分泌正常而血清IGF-I浓度正常或降低的矮身高儿童。因此，ISS儿童包括了骨龄延迟的矮身高儿童，在我们的研究中也是如此。因为在开始研究时治疗组骨龄的延迟相似，所以很可能未对所观察到的治疗组间骨龄增长和PAH差异产生影响。

    总之，芳香化酶抑制剂Lz治疗有效地延迟了ISS少年男孩骨成熟并改善了PAH。因而，芳香化酶抑制剂可能为不同病因的生长疾病提供一种新的有效治疗方法。Lz的耐受性良好，对骨的矿化无不利作用。但是我们认为，在获取到以芳香化酶抑制剂治疗男孩的长期追踪数据之前，在儿童和青少年应用芳香化酶抑制剂应仅限于临床实验。此外，需要以芳香化酶抑制剂治疗病人的成年身高数据来确定PAH的增加是否也导致成年身高的增加。