矮小症和正常身高儿童的生长激素刺激试验：免疫功能测定方法的使用
人类GH释放的昼夜节律使其难以精确和准确鉴别其分泌不足状态。因此，使GH分泌不足的诊断复杂起来，不仅需要评价儿童的身高、体重、生长速度人体测量学变量，而且也要测量生长因子的浓度，并要多次取血样确定GH的浓度。GH刺激试验已成为估价矮小症儿童GH状态的标准化处理方法。在大部分儿童，GH刺激试验也有助于评价GH治疗的可能益处。在美国的调查说明，80%以上的儿科内分泌医生常规使用GH刺激试验。但是，对刺激试验的正常反应因依赖于所使用的测定方法和以特定方法建立的的标准数据问题而难以捉摸。
最初GH刺激试验的研究以胰岛素引起低血糖，后来使用精氨酸为刺激物，早期的研究确立正常儿童的GH峰值至少~5mg/ml，但使用猪MAb抗人GH的GH测定对这个数值提出了挑战。单独或结合使用其它促分泌素，例如心得安（propranolol）和L-多巴胺、精氨酸和L-多巴胺、氯亚定都得出了不同的结果。最近，在正常生长的矮小症儿童大样本（n=472），对许多不同药物刺激的GH反应分析研究说明，许多正常儿童未能刺激血清GH浓度，表现出的数值显著低于惯例所采用的标准数值。但是，应用GH释放激素结合精氨酸或促生长素抑制素的抑制剂培维索孟（pyridostigmine）时，最小的GH反应也是高的（19ng/ml）。因此这些作者认为，如果不使用如此强大的促分泌素，这些试验将不能区别GH分泌充足和不足的儿童。在最近20年内，所确定的血清GH浓度峰正常值也有很大的不同，其范围由5ng/ml至7ng/ml，又到最近10ng/ml。尽管缺乏特定标准值的适当测定方法，但大部分美国内分泌医生未调整对刺激试验结果的解释。实际上，在美国调查的儿科内分泌医生中，70%以上认为诊断GH分泌不足的GH峰值为<10ng/ml。在研究工作中，大都多次采取血样来估价GH的分泌方式，但多次采血样似乎也不如评价为GH充足的刺激结果更准确。
GH治疗已发展为成年GH分泌不足的替代治疗，其目的并非线性生长，也同样遇到了诊断正常和异常GH状态的两难境地。对于治疗成年GH分泌不足病人的医生，这是一个特别重要的问题，因为不像在儿童病人那样有测量身高和生长速度优势。Hoffman et al.证明，有垂体疾病证据的成年人对胰岛素引起低血糖的GH反应峰明显低于年龄、性别和BMI相匹配的正常受试者，所有正常受试者的GH峰>5ng/ml，所有GH分泌不足受试者<3ng/ml。与24-小时GH浓度谱或IGF-I、IGFBP-3浓度测量相比，胰岛素引起的低血糖刺激实验也有最好的鉴别能力。这些研究和其它的数据产生了成年人GH分泌不足的最终试验推荐意见为，对胰岛素引起低血糖的GH反应峰值<3 ng/ml。
最近提出了一种高灵敏性的IFGH测定方法，这种测定方法使用了GH分子在两个结合位点上结合两种不同受体的概念，使用特异抗GH一个结合位点的重组GH结合蛋白（GHBP）和抗另一个结合位点的MAb，测量GH分子聚合两受体的能力，因而测量产生生物信号的能力。我们进行本研究，是要观察新的IFGH测定方法与两种灵敏的商业测定方法- DSL ELISA和Hybritech IRMA方法之间的关系。我们也再次研究了对正常身高儿童使用常规GH刺激试验并测量IGF-I、IGFBP-3和酸性不稳定亚单位，构建GH正常水平的问题。分析了矮身高儿童临床GH分泌不足的检查，并与一组正常身高儿童的数据进行了比较。
方法
本研究得到维吉尼亚大学Wolfson儿童医院临床研究评审委员会和学会评审委员会的批准。
受试者：在告知并经儿童及其父母同意后，作为矮身高（short stature，SS）和生长迟缓评价的一部分，在门诊募集了19名儿童（11男，8女），在试验前不知是否存在GH分泌不足。1名受试者在治疗GH分泌不足，身高生长已经停止，在做重复刺激试验。因此，在试验时其身高SDS并不矮（身高SDS为0.7）。为了比较，也由医疗中心的职员当中募集了13名健康儿童（5男，8女），都有正常的身高。表1为受试者临床特征。
研究设计 矮身高儿童使用精氨酸/L-多巴胺或精氨酸/胰岛素引起低血糖作为药物刺激剂进行GH刺激试验。在每时间点上多取血样进行如下述的额外测定。在整夜禁食后的清晨，受试者来到Wolfson儿童医院临床研究中心或维吉尼亚大学临床研究中心，在应用麻醉剂霜后，抽取血样用于测定几种激素。然后立即口服L-多巴胺（依体重不同，250或500mg），以0.5g/kg的剂量进行10%盐酸精氨酸30分钟的输液，在0，20，40，60，90和120分钟取血样用于测定GH浓度。并测量同一时间点的血浆IGF-I、IGFBP-3和ALS。采用精氨酸/胰岛素引起低血糖试验的病人（n=6）在取样60分钟后，接受0.075 U/kg的胰岛素，在120分钟试验过程中多次采集血样。在血浆葡萄糖浓度<40mg%时为血糖过低，仅1名受试者出现了胰岛素引起的血糖过低。正常对照组儿童都采用精氨酸/L-多巴胺试验。
测定 使用DSL ELISA方法测定GH浓度。该方法是一种酶增双抗夹心免疫测定，使用单克隆抗人-GH抗体，灵敏度为0.03ng/ml，测定批内和批间变异系数（CV）分别为4%和6%。使用世界卫生组织标准（88/624）校对测定标准。
此外，使用以前提出的DSL IFGH方法测定GH分子在两个不同结合位点结合能力的GH浓度。这种测定方法使用MAb抗GH分子结合位点2，以酰化重组GHBP结合GH的结合位点1。在孵化和洗涤后，以酰化重组GHBP孵化管壁，通过添加抗生蛋白链霉素标记的辣根过氧化物酶捕获GH分子的结合位点。因此测量的吸光度直接与占据两个GH受体结合位点的有生物活性的完整GH浓度成比例，批内和批间CV分别为3-5%和4-9%。依照WHO 88/624校对标准。
所有SS组的病人也都以IRMA方法测量GH浓度。测定使用两种抗GH分子两位点的MAb，灵敏度为0.2ng/ml，批内和批间CV分别为3-4%和3-5%。正常对照组也以这种测定方法进行分析。标准使用国家卫生研究所GH参照制剂HS2243E。
血浆IGF-I、IGFBP-3和ALS浓度使用DSL商业ELISA方法测量。
统计分析 使用参数t 检验分析两组所有测量生长因子的差异。使用多元逐步回归分析估价GH测定方法与其它生长因子和人体侧学指标的关系，显著性水平为 p<0.05。
结果
表2列出了本研究受试者的生长因子和三种不同方法测定的GH浓度，并与正常对照组进行了比较。无论使用免疫功能方法还是DSL ELISA方法,SS组的血清GH浓度相似，然而Hybritech测定方法始终较高。不管测定方法如何，组内GH峰值高度相关（图1）。SS组与对照组之间，每种方法测定的GH浓度（峰值或平均数）差异均无统计学显著性，但IFGH对DSL ELISA GH的曲线斜率（0.98）明显大于DSL ELISA GH对Hybritech IRMA GH（0.68）或IFGH对Hybritech GH的斜率（0.65），说明Hybritech IRMA方法测定的GH分子与DSL ELISA和IFGH方法不同。有趣的是，正常对照组测定的GH浓度范围宽大，在13名儿童中，应用不同测定方法测定的GH峰值<7ng/ml的儿童例数不同，使用IFGH方法有11名，使用DSL ELISA方法有6名，在使用常规Hybritech IRMA方法的9名儿童中有4名。实际上，在13名正常身高儿童中，使用常规DSL ELISA方法有46%的或6名儿童的GH水平<5ng/ml，使用Hybritech IRMA方法的9名儿童中有3名（33%）GH水平<5ng/ml（图2）。这些数据范围是在青春期前和青春期少年受试者所观察到的。在以胰岛素引起低血糖刺激试验的受试者也同样观察到了较低的GH峰值。
但是，SS组的血浆IGF-I、IGFBP-3、ALS的实际浓度或SDS始终低于对照组，甚至在将小于6岁的4名儿童排除后，这种差异依然存在。
在SS组进行多元回归分析以评价对刺激试验GH反应峰值（IFGH和ELISA方法）之间的关系，分析数据列于表3。在IFGH或ELISA的GH浓度峰值与血浆IGF-I、IGFBP-3、ALS浓度之间，在IFGH或ELISA GH浓度与身高SDS、BMI、生活年龄、线性生长速度之间的相关均无统计学显著性。
讨论
研究表明，SS组和正常儿童组IFGH方法与常规方法测定的GH高度相关，即使IRMA方法对矮身高儿童的测定值始终较高，但DSL ELISA和Hybritech IRMA方法相互之间以及与IFGH测定方法密切相关。这些数据提示，在所研究的大部分受试者中IFGH测定方法并不比ELISA方法优越很多，说明所检验的测定方法（标准的DSL ELISA或Hybritech IRMA方法）能够准确检测生物活性分子。
以前曾经报告SS由GH无生物学活性所引起，以高循环GH浓度为特征，缺乏GH作用，在给外源性GH后出现显著的赶上生长。已经发现，这种状况与GH-1基因突变有关，GH基因突变不仅不能刺激酪氨酸的磷酸化，而且还具有拮抗作用。确定是否存在免疫功能/免疫测定浓度比例异常的特发性SS病人（提示GH无生物活性），可能还需要以这两种测定方法在其它方面正常的特发性SS儿童大样本中进一步的研究。
本文所研究的正常身高的儿童使用了精氨酸与L-多巴胺或精氨酸与胰岛素引起低血糖刺激GH分泌，许多儿童对刺激的GH反应峰值低于惯例认可的界值点，使用DSL ELISA 或Hybritech IRMA方法测定，约50%的正常儿童峰值<7ng/ml，33-46%的儿童（使用Hybritech IRMA或DSL ELISA测定方法)低于5ng/ml。事实上，两名青春期发育完全正常的受试者GH浓度峰值在2ng/ml（使用IFGH和DSL ELISA GH方法）。总之，本研究和其它研究数据支持儿童GH刺激试验不能准确确定分泌不足的观点，除非GH水平很低（2ng/ml），使用通用的促分泌素和当代灵敏性的测定方法评价矮身高儿童时，武断的10、7、5ng/ml界值点无应用价值。但是，如果使用更强力的刺激（例如GH释放激素和培维索孟）能够较好地区分分泌不足和充足。
另一方面，循环生长因子测量表现出有趣的趋势。甚至在排除SS组小年龄儿童进行分析时，SS组的IGF-I、IGFBP-3、ALS浓度总体上低于正常对照组。因为所有这些肽类都有GH依赖性，所以正常儿童的浓度明显高于SS组的事实说明，测定这些生长因子可能比GH刺激试验更能够鉴别儿童GH分泌不足，这种原则得到了其它研究的支持。
使用3种方法测定的刺激实验GH反应峰值与普遍使用的身高、BMI、年龄、生长速度、IGF-I、IGFBP-3、ALS等人体侧学指标之间无相关，使其难以更好地预测GH治疗时的线性生长潜力。
据估计，美国42%的GH治疗儿童无典型的GH分泌不足，但是，其中有许多特发性SS儿童，GH增加线性生长和最终身高的效果确实不那么显著。因此，确立正确诊断儿童GH分泌不足的标准所节约的财力是大量的。其它方面正常，IGF-I、IGFBP-3和ALS浓度正常而在5%百分位数上生长的SS儿童不需要GH刺激试验，无CNS症状时也不需要后来的脑部磁共振成像。对于有低浓度循环生长因子和生长不良的儿童才应当进行GH刺激试验。
总之，在矮身高儿童GH刺激试验中使用新的IFGH测定方法与标准的GH DSL ELISA 和Hybritech IRMA方法高度相关，提示这些当代GH免疫测定方法大都能够检测产生的生物学信号。我们也证明，正常身高儿童GH浓度的增长可能达不到2ng/ml以上，而却有正常的依赖GH的生长因子循环水平。这些数据也说明，对通用刺激的GH反应峰值的异常标准是否是10、7、或是5ng/ml，仍然有待于研究。
我们结论为，正常GH刺激试验结果可能比以往公认的数值低许多。依赖GH的生长因子可能是比刺激的GH浓度更敏感的GH分泌不足指征。
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